ecodagЮг России: экология, развитиеSouth of Russia: ecology, development1992-10982413-0958State Institute of Applied Ecology of the Republic of Dagestan10.18470/1992-1098-2026-2-5ecodag-3711Research ArticleВИРУСОЛОГИЯVIROLOGYВалидация иммуноферментной тест‐системы на основе рекомбинантного антигена d34 для мониторинга протективного гуморального ответа к вирусу денге при иммунизации мышей вакцинным препаратом MVA‐d34Validation of a d34 recombinant antigen‐based ELISA for monitoring protective humoral immunity to dengue virus in MVA‐d34‐immunized micehttps://orcid.org/0009-0009-2889-9680ГогинаС. С.GoginaS. S.

Софья С. Гогина, м.н.с. лаборатории молекулярной биотехнологии

105064 г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5A

Тел. +79251486177

Sofya S. Gogina, Postgraduate Student, Junior Researcher, Laboratory of MolecularBiotechnology

5a Maly Kazenny pereulok, 105064

fominasofya@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0002-1527-949XЦыгановаГ. М.TsyganovaG. M.

Галина М. Цыганова

Москва

Galina M. Tsyganova

Moscow

https://orcid.org/0000-0002-5803-6263ЧереповичБ. С.CherepovichB. S.

Богдан С. Черепович

Москва

Bogdan S. Cherepovich

Moscow

https://orcid.org/0000-0002-8600-7347ОксаничА. С.OksanichA. S.

Алексей С. Оксанич

Москва

Alexey S. Oksanich

Moscow

 

Научно‐исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. МечниковаРоссияI.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research InstituteRussian FederationЦентр стратегического планирования и управления медико‐биологическими рисками здоровью Федерального медико‐биологического агентстваРоссияCentre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks, Federal Medical and Biological AgencyRussian Federation2026030820262124862Copyright © Гогина С.С., Цыганова Г.М., Черепович Б.С., Оксанич А.С., 20262026Гогина С.С., Цыганова Г.М., Черепович Б.С., Оксанич А.С.Gogina S.S., Tsyganova G.M., Cherepovich B.S., Oksanich A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://ecodag.elpub.ru/ugro/article/view/3711

Цель исследования — валидация иммуноферментной тест‐системы для полуколичественного определения специфических IgG‐антител к домену III E‐белка вируса денге (ДЕНВ) серотипов 1‐4 в сыворотке крови мышей.Коммерческие наборы реагентов АО БТК «Биосервис» (Москва, Россия). Рекомбинантный белок d34, экспрессированный в бакуловирусной системе. Сыворотки мышей линии BALB/c (n=100, 11 групп). Вируснейтрализующие антитела к серотипам D1–D4 ДЕНВ определяли методом реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero.Специфичность и чувствительность разработанной тест‐системы составили 100 % (95 % ДИ: 91,2–100,0 %), критический уровень ОП составил 0,16, CV не превышал 8,2 %. Исследование стабильности при 37 °С (14 сут) выявило снижение сигнала на 4,7 % (95 % ДИ: от –11,3 % до +1,9 %), что позволяет прогнозировать сохранение функциональных свойств иммуносорбента в течение 12 месяцев при хранении при 2–8 °С. Закономерное превышение значений ИФА над титрами РН отражает различие в детектируемых пулах антител и подтверждает целесообразность совместного применения обоих методов для комплексной оценки гуморального ответа.ИФА тест‐система обладает высокими диагностическими характеристиками и пригодна для полуколичественного определения специфических IgG‐антител к домену III E‐белка ДЕНВ в сыворотке лабораторных мышей. Ее применение обеспечивает надежный инструмент для доклинического мониторинга иммуногенности вакцинных кандидатов и создает методологическую основу для стандартизации контроля качества биопрепаратов на основе серотип‐ специфичных эпитопов.

To validate an enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) test system for the semi‐quantitative detection of specific IgG antibodies against domain III of the E protein of dengue virus (DENV) serotypes 1–4 in mouse serum. Commercial reagent kits (JSC BTK Bioservice, Moscow, Russia) were utilised. The recombinant d34 protein expressed in a baculovirus system served as the immunosorbent. Analytical performance was evaluated using a panel of 100 serum samples from BALB/c mice (11 groups). Virusneutralising antibodies against DENV serotypes D1–D4 were determined by a virus neutralisation test in Vero cell culture.The specificity and sensitivity of the test system developed both reached 100 % (95 % CI: 91.2–100.0 %), with a critical optical density (ODcrit) of 0.16 and a coefficient of variation (CV) not exceeding 8.2 %. Stability testing at 37°C for 14 days revealed a 4.7 % signal decrease (95 % CI: –11.3 % to +1.9 %), indicating that the immunosorbent is expected to retain its functional properties for up to 12 months when stored at 2–8°C. The systematically higher ELISA values compared to neutralisation test titers reflect differences in the detected antibody pools and support the combined use of both methods for a comprehensive evaluation of the humoral immune response.The validated ELISA test system exhibits high diagnostic performance and is suitable for the semi‐quantitative determination of specific IgG antibodies against domain III of the DENV E protein in laboratory mouse serum. Its application provides a reliable tool for preclinical monitoring of vaccine candidate immunogenicity and establishes a methodological basis for standardising the quality control of biologics targeting serotypespecific epitopes.

ИФАвирус денгеДЕНВDENVдомен III E‐белкаd34вируснейтрализующие антителавалидация аналитических методикMVAмодифицированная осповакцина Анкараmodified vaccinia AnkaraMVA‐d34ELISAdengue virusDENVdomain III of E proteind34virus‐neutralizing antibodiesvalidation of analytical methodsMVAmodified vaccinia AnkaraMVA‐d34Авторы выражают благодарность А.И. Желтухиной (ФГБУ «Научно‐исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева» Минздрава России) за проведение генотипирования штаммов вируса денге методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing), что позволило верифицировать серотип‐специфичную принадлежность коллекционных штаммов ДЕНВ D1–D4, использованных в исследовании, а также А.Г. Самарцевой за техническую помощь в наработке вирусных препаратов ДЕНВ.The authors are grateful to A.I. Zheltukhina (Smorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of Russia) for performing genotyping of dengue virus strains by next‐generation sequencing (NGS), which enabled verification of the serotype identity of the reference DENV D1–D4 strains used in this study, and to A.G. Samartseva for technical assistance in the propagation of dengue virus preparations.ReferencesAnumanthan G., Sahay B., Mergia A. Current Dengue Virus Vaccine Developments and Future Directions // Viruses. 2025. V. 17. N 2. P. 212. https://doi.org/10.3390/v17020212Anumanthan G., Sahay B., Mergia A. Current Dengue Virus Vaccine Developments and Future Directions // Viruses. 2025. V. 17. N 2. P. 212. https://doi.org/10.3390/v17020212Limothai U., Tachaboon S., Dinhuzen J., Hunsawong T., Ong‐Ajchaowlerd P., Thaisomboonsuk B., Fernandez S., Trongkamolchai S., Wanpaisitkul M., Chulapornsiri C. et al. Dengue pre‐vaccination screening test evaluation for the use of dengue vaccine in an endemic area // PLoS ONE. 2021. V. 16. N 9. e0257182. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0257182Limothai U., Tachaboon S., Dinhuzen J., Hunsawong T., Ong‐Ajchaowlerd P., Thaisomboonsuk B., Fernandez S., Trongkamolchai S., Wanpaisitkul M., Chulapornsiri C. et al. Dengue pre‐vaccination screening test evaluation for the use of dengue vaccine in an endemic area // PLoS ONE. 2021. V. 16. N 9. e0257182. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0257182Halstead S.B. Neutralization and antibody‐dependent enhancement of dengue viruses // Current Topics in Microbiology and Immunology / Ed. by U. Koszinowski, H. Wagner. Berlin: Springer. 2003. V. 267. С. 251–266. https://doi.org/10.1007/978‐3‐662‐06094‐2_13Halstead S.B. Neutralization and antibody‐dependent enhancement of dengue viruses // Current Topics in Microbiology and Immunology / Ed. by U. Koszinowski, H. Wagner. Berlin: Springer. 2003. V. 267. С. 251–266. https://doi.org/10.1007/978‐3‐662‐06094‐2_13Katzelnick L.C., Gresh L., Halloran M.E. et al. Antibodydependent enhancement of severe dengue disease in humans // Science. 2017. V. 358. N 6365. P. 929–932. https://doi.org/10.1126/science.aan6836Katzelnick L.C., Gresh L., Halloran M.E. et al. Antibodydependent enhancement of severe dengue disease in humans // Science. 2017. V. 358. N 6365. P. 929–932. https://doi.org/10.1126/science.aan6836Katzelnick L.C., Fonville J.M., Sang X. et al. Dengue viruses cluster antigenically but not as discrete serotypes // Science. 2015. V. 349. N 6254. P. 1338–1343. https://doi.org/10.1126/science.aaa4204Katzelnick L.C., Fonville J.M., Sang X. et al. Dengue viruses cluster antigenically but not as discrete serotypes // Science. 2015. V. 349. N 6254. P. 1338–1343. https://doi.org/10.1126/science.aaa4204Wahala W.M.P.B., Silva A.M. Natural strain variation and antibody neutralization of dengue serotype 3 viruses // PLoS Pathogens. 2010. V. 6. N 3. e1000821. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000821Wahala W.M.P.B., Silva A.M. Natural strain variation and antibody neutralization of dengue serotype 3 viruses // PLoS Pathogens. 2010. V. 6. N 3. e1000821. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000821Mintaev R.R., Glazkova D.V., Orlova O.V., Ignatyev G.M., Oksanich A.S., Shipulin G.A., Bogoslovskaya E.V. Development of MVA‐d34 tetravalent dengue vaccine: design and immunogenicity // Vaccines. 2023. V. 11. N 4. P. 831. https://doi.org/10.3390/vaccines11040831Mintaev R.R., Glazkova D.V., Orlova O.V., Ignatyev G.M., Oksanich A.S., Shipulin G.A., Bogoslovskaya E.V. Development of MVA‐d34 tetravalent dengue vaccine: design and immunogenicity // Vaccines. 2023. V. 11. N 4. P. 831. https://doi.org/10.3390/vaccines11040831ГОСТ 33215‐2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. М.: Стандартинформ, 2014.ГОСТ 33215‐2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. М.: Стандартинформ, 2014.ГОСТ 33216‐2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. М.: Стандартинформ, 2014.ГОСТ 33216‐2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. М.: Стандартинформ, 2014.Игнатьев Г.М., Оксанич А.С., Казакова Е.В., Самарцева Т.Г., Отрашевская Е.В., Уйба С.В., Трухин В.П. Изоляция и генетический анализ вируса Чикунгунья из комаров Aedes aegypti и Aedes albopictus, отловленных в Центральной Америке // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023. Т. 100. N 5. С. 310–318. https://doi.org/10.36233/0372‐9311‐354Игнатьев Г.М., Оксанич А.С., Казакова Е.В., Самарцева Т.Г., Отрашевская Е.В., Уйба С.В., Трухин В.П. Изоляция и генетический анализ вируса Чикунгунья из комаров Aedes aegypti и Aedes albopictus, отловленных в Центральной Америке // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023. Т. 100. N 5. С. 310–318. https://doi.org/10.36233/0372‐9311‐354Игнатьев Г.М., Каа К.В., Оксанич А.С. и др. Индикация и идентификация вирусов денге и Чикунгунья в комарах рода Aedes spp., отловленных в центральной Америке // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. Т. 97. N 3. С. 227–232. https://doi.org/10.36233/0372‐9311‐2020‐97‐3‐4Игнатьев Г.М., Каа К.В., Оксанич А.С. и др. Индикация и идентификация вирусов денге и Чикунгунья в комарах рода Aedes spp., отловленных в центральной Америке // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020. Т. 97. N 3. С. 227–232. https://doi.org/10.36233/0372‐9311‐2020‐97‐3‐4Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIII изд. Т. 1. Москва, 2015. 1470 с.Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIII изд. Т. 1. Москва, 2015. 1470 с.Беланова А.И., Ковалева Е.Л., Митькина Л.И. Сравнение подходов к изучению стабильности лекарственных средств в рамках национальной процедуры в России и Евразийском экономическом союзе // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2021. Т. 11. N 1. С. 16–23. https://doi.org/10.30895/1991‐2919‐2021‐11‐1‐16‐23Беланова А.И., Ковалева Е.Л., Митькина Л.И. Сравнение подходов к изучению стабильности лекарственных средств в рамках национальной процедуры в России и Евразийском экономическом союзе // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2021. Т. 11. N 1. С. 16–23. https://doi.org/10.30895/1991‐2919‐2021‐11‐1‐16‐23Russell P.K., Nisalak A., Sukhavachana P., Vivona S. A. Plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies // J. Immunol. 1967. V. 99. N 2. P. 285–290.Russell P.K., Nisalak A., Sukhavachana P., Vivona S. A. Plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies // J. Immunol. 1967. V. 99. N 2. P. 285–290.Morens D.M., Halstead S.B., Larsen L.K. Comparison of dengue virus plaque reduction neutralization by macro and "semi‐micro" methods in LLC‐MK2 cells // Microbiol. Immunol. 1985. V. 29. N 12. P. 1197–1205. https://doi.org/10.1111/j.1348‐0421.1985.tb00909.xMorens D.M., Halstead S.B., Larsen L.K. Comparison of dengue virus plaque reduction neutralization by macro and "semi‐micro" methods in LLC‐MK2 cells // Microbiol. Immunol. 1985. V. 29. N 12. P. 1197–1205. https://doi.org/10.1111/j.1348‐0421.1985.tb00909.xBaryshnikova V., Turchenko Y., Tuchynskaya K., Belyaletdinova I., Butenko A., Dereventsova A., Ignatiev G., Kholodilov I., Larichev V., Lyapeykova E., Rogova A., Shakaryan A., Shishova A., Gmyl A., Karganova G. Recombinant TBEV Protein E of the Siberian Subtype Is a Candidate Antigen in the ELISA Test System for Differential Diagnosis // Diagnostics. 2023. V. 13. N 20. P. 3277. https://doi.org/10.3390/diagnostics13203277Baryshnikova V., Turchenko Y., Tuchynskaya K., Belyaletdinova I., Butenko A., Dereventsova A., Ignatiev G., Kholodilov I., Larichev V., Lyapeykova E., Rogova A., Shakaryan A., Shishova A., Gmyl A., Karganova G. Recombinant TBEV Protein E of the Siberian Subtype Is a Candidate Antigen in the ELISA Test System for Differential Diagnosis // Diagnostics. 2023. V. 13. N 20. P. 3277. https://doi.org/10.3390/diagnostics13203277Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Внутрилабораторный контроль качества неколичественных методов ИФА // Справочник заведующего КДЛ. 2017. N 8. С. 65–74.Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Внутрилабораторный контроль качества неколичественных методов ИФА // Справочник заведующего КДЛ. 2017. N 8. С. 65–74.Dejnirattisai W., Jumnainsong A., Onsirisakul N. et al. A new class of highly potent, broadly neutralizing antibodies isolated from viremic patients infected with dengue virus // Nature Immunology. 2015. V. 16. N 2. P. 170–177. https://doi.org/10.1038/ni.3058Dejnirattisai W., Jumnainsong A., Onsirisakul N. et al. A new class of highly potent, broadly neutralizing antibodies isolated from viremic patients infected with dengue virus // Nature Immunology. 2015. V. 16. N 2. P. 170–177. https://doi.org/10.1038/ni.3058Tennakoon M.S.B.W.T.M.N.S., Lee K.‐H., Lee H.‐M., Park J.‐ Y., Shin H.‐J. Optimization of Conditions for Expression of Dengue Serotype 2 EDIII Protein in Escherichia coli and Immune Responses of Adjuvant‐Free EDIII Ferritin Nanoparticles Against Dengue Virus in BALB/c Mice // Viruses. 2025. V. 17. N 1. P. 129. https://doi.org/10.3390/v17010129Tennakoon M.S.B.W.T.M.N.S., Lee K.‐H., Lee H.‐M., Park J.‐ Y., Shin H.‐J. Optimization of Conditions for Expression of Dengue Serotype 2 EDIII Protein in Escherichia coli and Immune Responses of Adjuvant‐Free EDIII Ferritin Nanoparticles Against Dengue Virus in BALB/c Mice // Viruses. 2025. V. 17. N 1. P. 129. https://doi.org/10.3390/v17010129

The authors declare that there are no conflicts of interest present.